Kľúčový rozdiel - PCR priméry vs sekvenčné priméry
S najnovším vývojom v oblasti molekulárnej biológie boli vyvinuté rôzne genetické techniky, vďaka ktorým boli procesy vyšetrovania rôznych ciest subjektu ľahké a presné. PCR a ďalšie sekvenčné postupy sú dve dôležité také techniky. Používajú rôzne podzložky. Priméry sa považujú za hlavnú podzložku spoločnú pre obidve techniky PCR a sekvenovania. PCR priméry sa používajú na amplifikáciu konkrétnej sekvencie DNA, zatiaľ čo sekvenčné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifické poradie nukleotidovej sekvencie. Toto je kľúčový rozdiel medzi PCR primermi a sekvenčnými primermi.
OBSAH
1. Prehľad a kľúčový rozdiel
2. Čo sú PCR primery
3. Čo sú sekvenčné priméry
4. Podobnosti medzi PCR primermi a sekvenčnými primermi
5. Porovnanie vedľa seba - PCR priméry vs sekvenčné priméry v tabuľkovej forme
6. Zhrnutie
Čo sú PCR primery?
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je genetická technika, ktorá sa využíva v oblasti molekulárnej biológie na amplifikáciu jednej alebo niekoľkých kópií konkrétneho segmentu DNA a na získanie mnohých miliónov identických kópií. Pri PCR reakcii sa používajú rôzne komponenty vrátane primérov. Priméry sú krátke reťazce DNA s dĺžkou nukleotidu 18-25, vďaka čomu sú kompatibilné so začiatočnou a koncovou oblasťou fragmentov DNA, ktoré sa majú amplifikovať. Priméry môžu byť priamy a primárny primér. Tieto priméry sa viažu na fragment DNA v špecifických bodoch, v ktorých sa DNA polymeráza viaže na špecifický primér v danom mieste a iniciuje syntézu nového reťazca DNA.
Výber primérov je dôležitým aspektom procesu PCR. Dôležitý je výber dĺžky základného náteru. Ideálna dĺžka by bola 18-25 nukleotidov. Ak je dĺžka príliš krátka alebo príliš dlhá, priméry sa nebudú viazať na sekvenciu DNA, aby sa mohli presne amplifikovať. Primery, ktorých dĺžka je príliš krátka, vedie k nešpecifickému hybridizácii primérov na rôznych miestach sekvencie DNA.
Obrázok 01: PCR priméry
Obsah guanínu a cytozínu (GC) v dobrom základnom nátere by mal byť v rozmedzí 40 - 60. Teplota žíhania primeru a teplota topenia sú životne dôležitými faktormi počas PCR. Teplota topenia by sa mala vypočítať presne a teplota žíhania základného náteru by mala byť o 5 ° C nižšia ako teplota topenia. Teplota topenia by mala byť 60 ° C a 75 ° C. Príliš vysoké alebo príliš nízke teploty budú mať za následok nižšiu aktivitu DNA polymerázy.
Čo sú sekvenčné priméry?
Sekvenčné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifickú identitu. Pre získanie dobrých výsledkov sekvenovania sú dôležité vysoko kvalitné priméry a šablóny. Keď sú teda vybrané priméry, mali by byť jedinečné pre konkrétnu oblasť, v ktorej chceme sekvenovať. Malo by to byť tiež so správnou orientáciou, kde sa sekvencie zvyčajne generujú od 3 'do 5' koncov primérov. V tejto sekvencii by mala chýbať nežiadúca samohybridizácia, ako napríklad vytváranie vlásenkových slučiek. Nemal by obsahovať postupné vytváranie guanínových báz.
Teplota topenia (Tm) primeru musí byť vhodná pre podmienky sekvenovania. Preto by malo ležať medzi 52 ° C a 74 ° C. Príprava oligonukleotidov, ktoré sa majú použiť ako primér, by sa mala purifikovať, aby sa získala požadovaná celá dĺžka sekvencie. Ak oligonukleotidy obsahujú nečistoty, signalizácia sekvencie primérov sa superponuje z rôznych primovacích miest a tiež to zníži počet základných buniek.
Obrázok 02: Sekvenčné priméry
Teplota topenia priméru (Tm) oligonukleotidu určuje, ako silné sú komplementárne reťazce DNA navzájom hybridizované. Tm možno považovať za termodynamický výpočet, keď je závislý na oboch sekvenciách DNA a na niekoľkých podmienkach, ako je napríklad koncentrácia solí. Tm je dôležitý počas PCR, keď sa na produkciu skupiny fragmentov zakončených dideoxynukleotidom použije variant nazývaný sekvenovanie cyklu. Tu bude primér, ktorý je sekvenovaný, spočiatku alternatívne hybridizovaný, potom predĺžený a nakoniec denaturovaný na amplifikáciu. Preto by hodnota Tm mala byť medzi 52 o C a 74 oC. Syntetizované oligonukleotidy sa dajú získať z laboratórií na syntézu DNA / RNA podľa výberu. Malý rozsah syntézy, ktorý sa používa na sekvenovanie DNA, je zvyčajne 50 nmol. Najdôležitejšie je tiež očistiť priméry použité na sekvenovanie, aby neobsahovali nečistoty, ktoré bránia zníženiu kvality.
Aké sú podobnosti medzi PCR primermi a sekvenčnými primermi?
- PCR primery aj sekvenčné priméry sú priméry, ktoré sa používajú v procese amplifikácie cieľovej sekvencie DNA.
- PCR primery aj sekvenčné priméry sú zložené z nukleotidov.
- Ako PCR priméry, tak aj sekvenčné priméry sú krátke oligoméry.
Aký je rozdiel medzi PCR primermi a sekvenčnými primermi?
Rozdielny článok v strede pred tabuľkou
PCR priméry vs sekvenčné priméry |
|
| PCR priméry sú krátke reťazce DNA s dĺžkou nukleotidovej sekvencie 18 - 25, vďaka čomu sú kompatibilné so začiatočnou a koncovou oblasťou fragmentov DNA, ktoré sa majú amplifikovať. | Sekvenčné priméry sú krátke oligoméry, ktoré sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifickú identitu. |
| Funkcia | |
| Na amplifikáciu konkrétnej sekvencie DNA sa používajú priméry PCR. | Sekvenčné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifickú identitu. |
| Počet potrebných primérov | |
| Dva primery; jeden priamy primér a jeden reverzný primer sa používajú ako priméry PCR. | Potrebujete iba jeden primer ako sekvenčný primer. |
Zhrnutie - PCR priméry vs sekvenčné priméry
Sekvenčné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifickú identitu. Na spustenie procesu bude stačiť jeden sekvenčný primer. Pre získanie dobrých výsledkov sekvenovania sú dôležité vysoko kvalitné primery a šablóny. Keď sú teda vybrané priméry, mali by byť jedinečné pre konkrétnu oblasť, v ktorej chceme sekvenovať. PCR priméry sú krátke reťazce DNA s dĺžkou nukleotidu 18-25, ktorá je kompatibilná s počiatočnou a koncovou oblasťou fragmentov DNA, ktoré sa majú amplifikovať. PCR priméry môžu byť priamy a reverzný primer. Obsah guanínu a cytozínu (GC) v dobrom základnom nátere by mal byť v rozmedzí 40 - 60. Teplota temperovania primeru a teplota topenia sú životne dôležité aspekty počas PCR. To je rozdiel medzi PCR primermi a sekvenčnými primermi.
