Kľúčový rozdiel - PCR vs DNA sekvenovanie
PCR a sekvenovanie DNA sú dve dôležité techniky v molekulárnej biológii. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je proces, pri ktorom sa vytvára veľké množstvo kópií fragmentu DNA. Sekvenovanie DNA je technika, ktorá vedie k presnému poradiu nukleotidov daného fragmentu DNA. Toto je kľúčový rozdiel medzi PCR a sekvenovaním DNA. PCR je jedným z hlavných krokov zahrnutých do sekvenovania DNA.
OBSAH
1. Prehľad a hlavný rozdiel
2. Čo je to PCR
3. Čo je to sekvenovanie DNA
4. Porovnanie vedľa seba - PCR vs. sekvenovanie DNA
5. Zhrnutie
Čo je to PCR?
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je technika amplifikácie DNA používaná v molekulárnej biológii. Produkuje tisíce až milióny kópií konkrétneho fragmentu DNA. Túto metódu vyvinul Kary Mullis v roku 1983. V tejto technike slúži fragment DNA, ktorý sa má amplifikovať, ako templát a enzým DNA polymeráza dodáva komplementárne nukleotidy k priméru, ktorý je k dispozícii v zmesi PCR. Na konci PCR reakcie sa syntetizuje veľa kópií vzorky DNA.
Existujú rôzne zložky zmesi PCR, vrátane DNA, DNA polymerázy (Taq polymerázy), primérov (priame a reverzné priméry), nukleotidov (stavebné bloky DNA) a pufru. PCR prebieha vo vnútri prístroja PCR a do prístroja by mala byť vložená správna zmes PCR a mal by sa zaviesť správny program. Táto technika umožňuje produkciu tisícov až miliónov kópií konkrétnej časti DNA z veľmi malého množstva DNA.
PCR reakcie prebiehajú cyklicky a produkujú viditeľné množstvo produktov PCR na géli. Existujú tri hlavné kroky zapojené do PCR reakcie, a to denaturácia, anelovanie priméru a rozšírenie vlákna, ako je znázornené na obrázku 01. Tieto tri kroky prebiehajú pri troch rôznych teplotách. DNA existuje v dvojvláknovej forme pomocou vodíkových väzieb medzi komplementárnymi bázami. Pred implikáciou by mala byť dvojvláknová DNA od seba oddelená. Robí sa to pri vysokej teplote. Pri vysokej teplote sa dvojvláknová DNA denaturovala na jednovláknové. Potom by sa priméry mali priblížiť k priľahlým koncom špecifického fragmentu alebo génu DNA. Primer je krátky kúsok jednovláknovej DNA, ktorý je komplementárny k cieľovej sekvencii. Forwardové a reverzné priméry hybridizujú s komplementárnymi bázami na hraničných koncoch denaturovanej vzorky DNA pri teplote hybridizácie. Základné nátery by mali byť odolné voči teplu. Akonáhle priméry hybridizujú so vzorkou DNA, enzým taq polymeráza iniciuje syntézu nových vlákien pridaním nukleotidov, ktoré sú komplementárne k cieľovej DNA. Taq polymeráza je tepelne stabilný enzým izolovaný z termofilnej baktérie zvanej Thermus aquaticus. Pufr PCR udržuje optimálne podmienky pre pôsobenie taq polymerázy. Tieto tri stupne PCR reakcií sa opakujú, aby sa získalo požadované množstvo produktu PCR. Po každej PCR reakcii sa počet kópií DNA zdvojnásobil. Preto je možné pri PCR pozorovať exponenciálnu amplifikáciu. Produkty PCR je možné pozorovať pomocou gélovej elektroforézy a je možné ich purifikovať pre ďalšie štúdie.
Obrázok 01: Hlavné kroky PCR reakcie
PCR je cenným nástrojom v lekárskom a biologickom výskume. PCR má v kriminalistickej vede mimoriadnu hodnotu, pretože dokáže amplifikovať DNA pre štúdie z drobných vzoriek zločincov a vytvárať profily forenznej DNA. PCR sa široko používa v mnohých oblastiach molekulárnej biológie vrátane genotypovania, klonovania génov, detekcie mutácií, sekvenovania DNA, mikročipov DNA a testovania otcovstva atď.
Obrázok 02: Polymerázová reťazová reakcia
Čo je to sekvenovanie DNA?
Sekvenovanie DNA je stanovenie presného poradia nukleotidov - adenínu, guanínu, cytozínu a tymínu v danom fragmente DNA. Genetická informácia je uložená v sekvenciách DNA pomocou správneho poradia nukleotidov. Zistenie presného poradia nukleotidov vo fragmente DNA je preto veľmi dôležité vedieť o štruktúre a funkcii génov.
Protokol sekvenovania DNA zahŕňa rôzne procesy. Prvým krokom je izolácia zainteresovanej DNA alebo genomickej DNA organizmu. Použitím PCR (ako je opísané vyššie) by sa mala amplifikovať požadovaná oblasť DNA. Amplifikovaný produkt PCR by sa mal oddeliť gélovou elektroforézou a vyčistiť. Amplifikované fragmenty sa slúžia ako šablóny na sekvenovanie. Sekvenovanie je možné vykonať buď podľa Sangerovho sekvenovania, alebo pomocou vysoko výkonnej sekvenčnej metódy. Sangerovo sekvenovanie vyžaduje kapilárnu elektroforézu výsledných fragmentov DNA. Stanovenie správneho poradia nukleotidov je možné vykonať manuálnym čítaním autorádiografov alebo použitím automatických DNA sekvenátorov.
Génové sekvenovanie prispelo k projektu ľudského genómu a uľahčilo mapovanie ľudského genómu v roku 2003. Vo forenznej oblasti umožnilo sekvenovanie DNA identifikáciu osôb, ktoré vykazujú jedinečné sekvencie DNA a identifikujú zločincov. V medicíne sa sekvenovanie DNA môže použiť na detekciu génov zodpovedných za genetické a iné choroby, nájdenie defektných génov a ich nahradenie správnymi génmi. V poľnohospodárstve sa informácie o sekvenovaní DNA niektorých mikroorganizmov používajú na produkciu transgénnych plodín s ekonomicky požadovanými vlastnosťami.
Obrázok 03: Sekvenovanie DNA
Aký je rozdiel medzi PCR a DNA sekvencovaním?
Rozdielny článok v strede pred tabuľkou
PCR vs DNA sekvenovanie |
|
| Proces PCR vytvára tisíce až milióny kópií zainteresovaného fragmentu DNA. | Sekvenovanie DNA je proces určovania presného poradia nukleotidov v danom fragmente DNA. |
| Výsledok | |
| PCR vytvára tisíce až milióny kópií konkrétneho fragmentu DNA | To vedie k správnemu poradiu báz v konkrétnom fragmente DNA. |
| Zapojenie ddNTP | |
| PCR nevyžaduje ddNTP. Používa dNTP. | Sekvenovanie DNA vyžaduje ddNTP na ukončenie tvorby vlákna. |
Zhrnutie - PCR vs DNA sekvenovanie
PCR a sekvenovanie DNA sú veľmi dôležitými nástrojmi v mnohých oblastiach molekulárnej biológie. Amplifikácia fragmentov DNA sa uskutočňuje technikou PCR, zatiaľ čo správne poradie nukleotidov fragmentu DNA je určené sekvenovaním DNA. To je rozdiel medzi PCR a sekvenovaním DNA.
