PCR vs PCR v reálnom čase
PCR alebo polymerázová reťazová reakcia je revolučný objav v modernej molekulárnej biológii, ktorý ako prvý vyvinul chemik Kary Mullis v roku 1983. Umožňuje amplifikáciu jednej sekvencie v komplexnej DNA na analýzu. Základnou myšlienkou PCR je, že dva priméry, ktoré sú komplementárne s opačnými vláknami sekvencie DNA, sú orientované proti sebe; primery produkujú komplementárne vlákna, z ktorých každý obsahuje druhý primér. Výsledkom je teda veľké množstvo sekvencie zodpovedajúcej DNA, ktorá leží medzi dvoma primermi. Na predĺženie primerov v PCR sa používa enzým DNA polymeráza. DNA polymeráza je termostabilný enzým a má schopnosť prežiť pri vysokých teplotách (94 až 95 ° C) používaných na denaturáciu templátovej DNA.
PCR zahrnuje tri kroky, a to opakované denaturačné cykly, hybridizáciu primérov a syntézu DNA. Na uskutočnenie tejto reakcie sa používa termocykler. Je možné ho naprogramovať na rýchlu a presnú zmenu teplôt. Aplikácie PCR sú trestné vyšetrovanie, DNA odtlačok prsta, detekcia patogénov a analýza DNA raných ľudských druhov.
Čo je to konvenčná PCR?
Existujú tri hlavné stupne konvenčnej PCR, a to; Fáza amplifikácie DNA, separácia PCR a detekcia produktov. Separácia segmentov DNA sa typicky uskutočňuje elektroforézou na agarózovom géli. Výrobky sa potom zafarbia etheiduimbromidom. Nakoniec sa detekcia dosiahne vizualizáciou pásov na géloch pod UV svetlom. Preto konečné výsledky konvenčnej PCR nie sú vyjadrené ako čísla. Obvykle je konvenčná PCR schopná detegovať iba jeden parameter.
Čo je to real-time PCR?
PCR v reálnom čase dokáže detekovať amplifikáciu produktov, pretože produkty sú syntetizované. S rozvojom technológie sa PCR stala veľmi populárnou technikou, najmä na detekciu a identifikáciu baktérií v potravinách. PCR v reálnom čase využíva systém fluorescenčných farbív a termocyklér vybavený schopnosťou fluorescenčnej detekcie.
Aký je rozdiel medzi konvenčnou PCR a PCR v reálnom čase?
• Konvenčná PCR je časovo náročnejšia, pretože na analýzu amplifikovaných produktov PCR využíva gélovú elektroforézu. Naproti tomu PCR v reálnom čase je časovo menej náročná, pretože dokáže detegovať amplifikácie v počiatočných fázach reakcie.
• PCR v reálnom čase zhromažďuje údaje vo fáze exponenciálneho rastu PCR, zatiaľ čo tradičná PCR zhromažďuje údaje v koncovom bode reakcie.
• Výsledky koncového bodu konvenčnej PCR nemusia byť veľmi presné, ale výsledky PCR v reálnom čase sú veľmi presné.
• PCR v reálnom čase je citlivejšia ako konvenčná PCR.
• Konvenčná PCR má veľmi zlé rozlíšenie, zatiaľ čo PCR v reálnom čase dokáže detekovať veľmi malé zmeny kvôli vysokému rozlíšeniu.
• Detekcia koncového bodu konvenčnej PCR má krátky dynamický rozsah, zatiaľ čo detekcia PCR v reálnom čase má široký dynamický rozsah.
• Na rozdiel od konvenčnej PCR sa automatizované detekčné techniky nachádzajú v PCR v reálnom čase.
• Konvenčná PCR je vysoko sofistikovaná a náročnejšia na prácu ako PCR v reálnom čase.
• Na rozdiel od PCR v reálnom čase nemôže konvenčná PCR rozlišovať medzi mŕtvymi a živými baktériami.
• PCR v reálnom čase používa na detekciu produktov systém fluorescenčných farbív, zatiaľ čo bežná PCR používa na vizualizáciu pásov v agarózovom gélovom médiu etídiumbromid a UV svetlo.
