Kľúčový rozdiel - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotidy sú základné štruktúrne jednotky a stavebné prvky DNA. Molekula DNA je zložená z polynukleotidového reťazca. V DNA sa nachádzajú štyri rôzne nukleotidy. Tieto nukleotidy pozostávajú zo štyroch rôznych dusíkatých báz, ktoré sa nazývajú A (adenín), G (guanín), C (cytozín), T (tymín). Poradie nukleotidov v molekule DNA má veľký význam, pretože kóduje dôležitú genetickú informáciu pre rast a vývoj organizmov. Sekvenovanie DNA sa týka procesu, ktorý určuje presnú nukleotidovú sekvenciu DNA. Existujú rôzne metódy sekvenovania DNA. Maxam Gilbertovo sekvenovanie a Sangerovo sekvenovanie DNA sú dve metódy sekvenovania DNA, ktoré patria do sekvenovania prvej generácie. Postup sekvenovania Maxam Gilbert určuje bázovú sekvenciu chemickým štiepením 5 'konca označených fragmentov DNA prednostne na každom zo štyroch nukleotidov a gélovou elektroforézou. Procedúra Sangerovho sekvenovania určuje nukleotidovú sekvenciu syntetizáciou jednovláknovej DNA pomocou DNA polymerázy a dideoxynukleotidov a gélovou elektroforézou. Toto je kľúčový rozdiel medzi Maxamom Gilbertom a Sangerovým sekvenovaním.
OBSAH
1. Prehľad a hlavný rozdiel
2. Čo je Maxam Gilbert
3. Čo je Sangerovo sekvenovanie
4. Porovnanie vedľa seba - Maxam Gilbert vs. Sangerovo sekvenovanie
5. Zhrnutie
Čo je postupnosť Maxam Gilbert?
Maxam Gilbertovo sekvenovanie, tiež známe ako metóda chemického sekvenovania, je technika vyvinutá na stanovenie poradia nukleotidov v DNA. Túto metódu zaviedli Walter Gilbert a Alan Maxam v roku 1976 a stala sa populárnou, pretože ju možno vykonať priamo s purifikovanou DNA. Metóda Maxama Gilberta patrí k prvej generácii sekvenovania DNA a bola to prvá metóda sekvenovania, ktorú vedci široko používajú.
Základný princíp tejto metódy spočíva v obmedzení koncovo označených fragmentov DNA na špecifických bázach bázicky špecifickými chemikáliami a podmienkami a separácii označených fragmentov elektroforézou, ako je to znázornené na obrázku 01. Fragmenty sa oddeľujú podľa veľkosti na gél. Pretože sú fragmenty označené, je možné ľahko odvodiť sekvenciu molekuly DNA.
Metóda Maxama Gilberta používa bázické špecifické chemikálie na rozbitie DNA na špecifických bázach. Na selektívny útok na puríny a pyrimidíny sa používajú dve bežné chemikálie, ktoré sa nazývajú dimetylsulfátové a hydrazínové chemikálie.
Metóda sekvenovania Maxama Gilberta sa uskutočňuje niekoľkými nasledujúcimi krokmi.
- Čistenie sekvencie DNA pomocou reštrikčných endonukleáz
- Značenie koncov fragmentov DNA pridaním rádioaktívnych fosfátov
- Čistenie značených fragmentov z neznačených fragmentov gélovou elektroforézou
- Separácia koncovo označenej DNA do štyroch skúmaviek a samostatné ošetrenie so špecifickými chemickými látkami
- Elektroforéza obsahu každej skúmavky na samostatných linkách na géli a separácia fragmentov podľa ich dĺžky.
- Detekcia fragmentov autorádiografom.
Obrázok 01: Sekvenovanie Maxama Gilberta
Čo je to Sangerovo sekvenovanie?
Sanger Sequencing je sekvenčná metóda vyvinutá Frederickom Sangerom a jeho kolegami v roku 1977 na stanovenie základnej sekvencie daného fragmentu DNA. Je tiež známa ako sekvenčné ukončenie reťazca alebo metóda dideoxy sekvenovania. Táto metóda funguje na princípe selektívneho zabudovania dideoxynukleotidov ukončujúcich reťazce (ddNTP), ako sú ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, pomocou DNA polymerázy počas syntézy jednovláknovej DNA na ukončenie tvorby vlákna. Dideoxynukleotidom chýbajú 3 'OH skupiny na tvorbu fosfodiesterových väzieb so susedným nukleotidom. Tvorba vlákna sa teda zastaví, akonáhle je ddNTP začlenený do novo sa formujúceho vlákna počas sekvenovania sangerov.
V tejto metóde sa uskutočňujú štyri samostatné reakcie na syntézu DNA (PCR) v štyroch samostatných skúmavkách s jedným typom ddNTP. Pre skúmavky pre PCR sa dodávajú aj ďalšie požiadavky, vrátane primerov, dNTP, Taq polymerázy, špecifických podmienok atď. Štyri samostatné reakcie sa uskutočňujú v štyroch skúmavkách so štyrmi zmesami. Po PCR reakciách sú výsledné fragmenty DNA tepelne denaturované a oddelené gélovou elektroforézou. Potom sa fragmenty vizualizujú pomocou buď označeného (rádioaktívneho alebo fluorescenčného) priméru alebo dNTP, ako je znázornené na obrázku 02.
Obrázok 02: Postupné radenie
Aký je rozdiel medzi Maxam Gilbert a Sanger Sequencing?
Rozdielny článok v strede pred tabuľkou
Maxam Gilbert vs Sangerovo sekvenovanie |
|
| Sekvenovanie Maxama Gilberta je prvou technikou vyvinutou pre sekvenovanie DNA. | Metóda Sangerovho sekvenovania bola predstavená po metóde sekvenovania Maxama Gilberta. |
| Využitie | |
| Táto metóda sa používa zriedka. | Na sekvenovanie sa bežne používa Sangerovo sekvenovanie. |
| Používanie nebezpečných chemikálií | |
| Používa nebezpečné chemikálie. | Používanie nebezpečných chemikálií je v porovnaní s metódou Maxama Gilberta obmedzené. |
| Označenie na detekciu | |
| Táto metóda používa rádioaktívne P 32 pre označenie koncov fragmentov DNA. | Sangerovo sekvenovanie používa rádioaktívne alebo fluorescenčne označené ddNTP. |
Zhrnutie - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert a Sanger sekvenovanie sú dva typy techník sekvenovania DNA spadajúcich pod sekvenovanie DNA prvej generácie. Maxam Gilbertovo sekvenovanie je prvou metódou zavedenou pre sekvenovanie DNA v roku 1976 a uskutočňuje sa rozbitím koncových označených fragmentov DNA bázicky špecifickými chemikáliami. Preto je známe ako chemické sekvenovanie. Metóda Sangerovho sekvenovania bola predstavená v roku 1977 a je založená na ddNTP riadených reakciách ukončenia reťazca. Sangerova sekvenčná metóda je populárna ako metóda Maxama Gilberta kvôli niekoľkým nevýhodám metódy Maxama Gilberta, ako je nadmerná spotreba času, použitie nebezpečných chemikálií atď. To je rozdiel medzi Maxamom Gilbertom a Sangerovým sekvenovaním.
