Kľúčový rozdiel - NGS vs Sangerovo sekvenovanie
Next Generation Sequencing (NGS) a Sangerovo sekvenovanie sú dva typy techník nukleotidového sekvenovania vyvinutých v priebehu času. Metóda Sangerovho sekvenovania bola široko používaná mnoho rokov a NGS ju nedávno nahradila kvôli svojim výhodám. Kľúčovým rozdielom medzi NGS a Sangerovým sekvenovaním je to, že NGS pracuje na princípe sekvenovania miliónov sekvencií súčasne rýchlym spôsobom prostredníctvom sekvenčného systému, zatiaľ čo Sangerovo sekvenovanie funguje na princípe ukončenia reťazca vďaka selektívnej inkorporácii dideoxynukleotidov enzýmom DNA polymerázy. počas replikácie DNA a výslednej separácie fragmentov kapilárnou elektroforézou.
OBSAH
1. Prehľad a hlavný rozdiel
2. Čo je nukleotidové sekvenovanie
3. Čo je NGS
4. Čo je Sangerovo sekvenovanie
5. Porovnanie vedľa seba - NGS vs. Sangerovo sekvenovanie
6. Zhrnutie
Čo je nukleotidové sekvenovanie?
Genetická informácia je uložená v nukleotidových sekvenciách DNA alebo RNA organizmu. Proces určovania správneho poradia nukleotidov (pomocou štyroch báz) v danom fragmente (v géne, zoskupení génov, chromozóme a úplnom genóme) je známy ako nukleotidové sekvenovanie. Pri genómových štúdiách, forenzných štúdiách, virológii, biologickej systematike, lekárskej diagnostike, biotechnológiách a v mnohých ďalších oblastiach je veľmi dôležité analyzovať štruktúru a funkciu génov. Vedci vyvíjajú rôzne typy metód sekvenovania. Medzi nimi bolo široko používané a dlho popularizované Sangerovo sekvenovanie vyvinuté Frederickom Sangerom v roku 1977, kým ho nenahradilo sekvenovanie novej generácie.
Čo je NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) je termín používaný na označenie moderných vysoko výkonných procesov sekvenovania. Opisuje množstvo rôznych moderných technológií sekvenovania, ktoré priniesli revolúciu v genomických štúdiách a molekulárnej biológii. Týmito technikami sú sekvenovanie Illumina, sekvenovanie Roche 454, sekvenovanie iónových protónov a sekvenovanie SOLiD (sekvenovanie detekciou ligáciou oligomérov). Systémy NGS sú rýchlejšie a lacnejšie. V systémoch NGS sa používajú štyri hlavné metódy sekvenovania DNA; pyrosekvenovanie, sekvenovanie syntézou, sekvenovanie ligáciou a iónové polovodičové sekvenovanie. Paralelne možno sekvenovať veľké množstvo reťazcov DNA alebo RNA (milióny). Umožňuje sekvenovanie celého genómu organizmov v krátkom časovom období, na rozdiel od Sangerovho sekvenovania, ktoré trvá dlhšie.
NGS má veľa výhod oproti konvenčnej Sangerovej metóde sekvenovania. Jedná sa o vysokorýchlostný, presnejší a nákladovo efektívny proces, ktorý je možné vykonať s malou veľkosťou vzorky. NGS sa môže použiť v metagenomických štúdiách, pri detekcii variácií v rámci jednotlivého genómu v dôsledku inzercie a delécie atď. A pri analýze génovej expresie.
Obrázok_1: Vývoj v postupnosti NGS
Čo je to Sangerovo sekvenovanie?
Sangerovo sekvenovanie je metóda sekvenovania vyvinutá Frederickom Sangerom a jeho kolegami v roku 1977 na určenie presného poradia nukleotidov daného fragmentu DNA. Je tiež známe ako sekvenovanie terminácie reťazca alebo dideoxy sekvenovanie. Princípom tejto metódy je ukončenie syntézy vlákna selektívnym začlenením dideoxynukleotidov (ddNTP) ukončujúcich reťazce, ako sú ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, DNA polymerázou počas replikácie DNA. Normálne nukleotidy majú 3 'OH skupiny na tvorbu fosfodiesterovej väzby medzi susednými nukleotidmi, aby pokračovali vo vytváraní vlákna. Avšak ddNTPs nemajú túto 3 'OH skupinu a nie sú schopné vytvárať fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi. Predĺženie reťazca je teda zastavené.
V tejto metóde slúži jednoreťazcová DNA, ktorá sa má sekvenovať, ako templátové vlákno pre syntézu DNA in vitro. Ďalšími požiadavkami sú oligonukleotidový primer, prekurzory deoxynukleotidov a enzým DNA polymeráza. Pokiaľ sú známe susedné konce cieľového fragmentu, je možné ľahko navrhnúť priméry na replikáciu DNA. Štyri samostatné reakcie syntézy DNA sa uskutočňujú v štyroch samostatných skúmavkách. Každá skúmavka má samostatné ddNTP, spolu s ďalšími požiadavkami. Z konkrétneho nukleotidu sa pridá zmes dNTP a ddNTP. Rovnako sa uskutočňujú štyri samostatné reakcie v štyroch skúmavkách so štyrmi zmesami. Po reakciách sa uskutoční detekcia fragmentov DNA a konverzia obrazca fragmentu na informáciu o sekvencii. Výsledné fragmenty DNA sa tepelne denaturujú a separujú gélovou elektroforézou. Ak sa použijú rádioaktívne nukleotidy, pruhovanie v polyakrylamidovom géli je možné vizualizovať autorádiografiou. Keď táto metóda používa fluorescenčne označené dideoxynukleotidy, je možné ju zmierniť smerom dole na géli a prejsť laserovým lúčom, ktorý sa deteguje fluorescenčným detektorom. Aby sa zabránilo chybám, ktoré by mohli vzniknúť pri načítaní sekvencie do oka a pri manuálnom zadávaní do počítača, vyvinula sa táto metóda v použití automatizovaného radiča spojeného s počítačom. Aby sa zabránilo chybám, ktoré by mohli vzniknúť pri načítaní sekvencie do oka a pri manuálnom zadávaní do počítača, vyvinula sa táto metóda v použití automatizovaného radiča spojeného s počítačom. Aby sa zabránilo chybám, ktoré by mohli vzniknúť pri načítaní sekvencie do oka a pri manuálnom zadaní do počítača, vyvinula sa táto metóda v použití automatizovaného radiča spojeného s počítačom.
Toto je metóda použitá na sekvenovanie DNA z projektu Human Genome. Táto metóda sa stále používa s pokročilými úpravami, pretože poskytuje presné informácie o postupe napriek tomu, že je to drahý a pomalý proces.
Obrázok_2: Postupné radenie
Aký je rozdiel medzi NGS a Sangerovým sekvenovaním?
Rozdielny článok v strede pred tabuľkou
NGS vs Sangerovo sekvenovanie |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) označuje moderné vysoko výkonné sekvenčné procesy. Opisuje množstvo rôznych moderných technológií sekvenovania | Sangerovo sekvenovanie je metóda sekvenovania, ktorú vyvinul Frederick Sanger na stanovenie presného poradia nukleotidov daného fragmentu DNA. |
| Efektivita nákladov | |
| NGS je lacnejší proces, pretože znižuje čas, ľudskú silu a chemikálie. | Toto je nákladný proces, pretože to vyžaduje čas, ľudskú silu a viac chemikálií. |
| Rýchlosť | |
| Je to rýchlejšie, pretože chemická detekcia aj detekcia signálov mnohých vlákien prebiehajú paralelne. | To je časovo náročné, pretože chemická detekcia a detekcia signálu prebiehajú ako dva samostatné procesy a naraz ich môže čítať iba na reťazci. |
| Spoľahlivosť | |
| NGS je spoľahlivá. | Sangerovo radenie je menej spoľahlivé |
| Veľkosť vzorky | |
| NGS vyžaduje menšie množstvo DNA. | Táto metóda vyžaduje veľké množstvo templátovej DNA. |
| Bázy DNA na sekvenovaný fragment | |
| Počet báz DNA na sekvenovaný fragment je nižší ako Sangerova metóda | Generujúce sekvencie sú zdĺhavejšie ako sekvencie NGS. |
Zhrnutie - NGS vs Sangerovo sekvenovanie
NGS a Sangerovo sekvenovanie sú techniky nukleotidového sekvenovania, ktoré sa vo veľkej miere používajú v molekulárnej biológii. Sangerovo sekvenovanie je metóda skorého sekvenovania, ktorá bola nahradená NGS. Hlavný rozdiel medzi NGS a Sangerovým sekvenovaním je ten, že NGS je vysokorýchlostný, presnejší a nákladovo efektívny proces ako Sangerovo sekvenovanie. Obidve techniky spôsobili veľké ohniská v genetike a biotechnológii.
