Kľúčový rozdiel - Sangerovo sekvenovanie vs. pyrosekvenovanie
Sekvenovanie DNA je pre analýzu DNA veľmi dôležité, pretože znalosť správneho usporiadania nukleotidov v konkrétnej oblasti DNA odhaľuje mnoho dôležitých informácií o nej. Existujú rôzne metódy sekvenovania DNA. Sangerovo sekvenovanie a pyrosekvenovanie sú dve rôzne metódy sekvenovania DNA, ktoré sa široko používajú v molekulárnej biológii. Kľúčovým rozdielom medzi Sangerovým sekvencovaním a pyrosekvenovaním je, že Sangerovo sekvenovanie využíva dideoxynukleotidy na ukončenie syntézy DNA na čítanie nukleotidovej sekvencie, zatiaľ čo pyrosekvenovanie detekuje uvoľnenie pyrofosfátu začlenením nukleotidov a syntetizáciou komplementárnej sekvencie na čítanie presného poradia sekvencie.
OBSAH
1. Prehľad a hlavný rozdiel
2. Čo je Sangerovo sekvenovanie
3. Čo je pyrosekvenovanie
4. Porovnanie vedľa seba - Sangerovo sekvenovanie vs. pyrosekvenovanie
5. Zhrnutie
Čo je to Sangerovo sekvenovanie?
Sangerovo sekvenovanie je metóda sekvenovania DNA prvej generácie, ktorú vyvinul Frederick Sanger a jeho vysoké školy v roku 1977. Je tiež známa ako sekvenovanie reťazca alebo dideoxy sekvenovanie, pretože je založená na ukončení reťazca dideoxynukleotidmi (ddNTP). Táto metóda bola široko používaná viac ako 30 rokov, kým nebolo vyvinuté sekvenovanie novej generácie (NGS). Technika Sangerovho sekvenovania umožnila objavenie správneho poradia nukleotidov alebo pripojenie konkrétneho fragmentu DNA. Je založená na selektívnom zabudovaní ddNTP a ukončení syntézy DNA počas replikácie DNA in vitro. Neprítomnosť 3 'OH skupín, aby sa pokračovalo vo vytváraní fosfodiesterovej väzby medzi susednými nukleotidmi, je jedinečnou vlastnosťou ddNTP. Akonáhle je teda pripojený ddNTP, predĺženie reťazca sa zastaví a od tohto bodu sa ukončí. V Sangerovom sekvenovaní sú použité štyri ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP a ddTTP. Tieto nukleotidy zastavujú proces replikácie DNA, keď sú začlenené do rastúceho reťazca DNA, a vedú k rôznej dĺžke krátkej DNA. Na usporiadanie týchto krátkych vlákien DNA podľa ich veľkostí na géli sa používa kapilárna gélová elektroforéza, ako je znázornené na obrázku 01.
Obrázok 1: Elektroforéza kapilárneho gélu syntetizovanej krátkej DNA
Pre replikáciu DNA in vitro by sa malo poskytnúť niekoľko požiadaviek. Sú to DNA polymerázový enzým, templátová DNA, oligonukleotidové priméry a deoxynukleotidy (dNTP). V Sangerovom sekvenovaní sa replikácia DNA uskutočňuje v štyroch samostatných skúmavkách spolu so štyrmi typmi ddNTP zvlášť. Deoxynukleotidy nie sú úplne nahradené príslušnými ddNTP. Zmes konkrétneho dNTP (napríklad; dATP + ddATP) je zahrnutá v skúmavke a replikovaná. Štyri samostatné skúmavky sú nanesené na géle v štyroch oddelených jamkách. Potom po prečítaní gélu je možné zostaviť sekvenciu, ako je znázornené na obrázku 02.
Obrázok 02: Sangerovo sekvenovanie
Sangerovo sekvenovanie je dôležitá technika, ktorá pomáha v mnohých oblastiach molekulárnej biológie. Projekt ľudského genómu bol úspešne dokončený pomocou metód založených na Sangerovom sekvenovaní. Sangerovo sekvenovanie je tiež užitočné pri sekvenovaní cieľovej DNA, výskume rakoviny a genetických chorôb, analýze génovej expresie, identifikácii človeka, detekcii patogénov, mikrobiálnom sekvenovaní atď.
Existuje niekoľko nevýhod Sangerovho radenia:
- Dĺžka sekvenovanej DNA nemôže byť dlhšia ako 1 000 párov báz
- Naraz je možné sekvenovať iba jeden reťazec.
- Tento proces je časovo náročný a nákladný.
Preto boli s cieľom prekonať tieto problémy vyvinuté nové pokročilé techniky sekvenovania. Avšak Sangerovo sekvenovanie sa stále používa kvôli svojim vysoko presným výsledkom až do fragmentov s dĺžkou približne 850 párov báz.
Čo je pyrosekvenovanie?
Pyrosekvenovanie je nová technika sekvenovania DNA založená na „sekvenovaní syntézou“. Táto technika spočíva v detekcii uvoľňovania pyrofosfátu po inkorporácii nukleotidu. Tento proces sa využíva pomocou štyroch rôznych enzýmov: DNA polymerse, ATP sulfurylázy, luciferázy a apyrázy a dvoch substrátov adenozín 5 'fosfosulfátu (APS) a luciferínu.
Proces začína väzbou priméru s jednoreťazcovým DNA templátom a DNA polymeráza začína inkorporáciu nukleotidov, ktoré sú k nej komplementárne. Keď sa nukleotidy spoja (polymerizácia nukleových kyselín), uvoľní pyrofosfátové (dve fosfátové skupiny spojené dohromady) skupiny a energiu. Každé pridanie nukleotidu uvoľňuje ekvimolárne množstvo pyrofosfátu. Pyrofosfát sa prevádza na ATP pomocou ATP sulfurylázy v prítomnosti substrátu APS. Vytvorený ATP riadi luciferázou sprostredkovanú premenu luciferínu na oxyluciferín, pričom produkuje viditeľné svetlo v množstvách, ktoré sú úmerné množstvu ATP. Svetlo je detekované prístrojom na detekciu fotónov alebo fotonásobičom a vytvára pyrogram. Apyráza degraduje ATP a neinkorporované dNTP v reakčnej zmesi. Pridanie dNTP sa vykonáva naraz. Pretože prídavok nukleotidu je známy na základe inkorporácie a detekcie svetla, je možné určiť sekvenciu templátu. Pyrogram sa používa na generovanie nukleotidovej sekvencie vzorky DNA, ako je to znázornené na obrázku 03.
Pyrosekvenovanie je veľmi dôležité pri analýze polymorfizmu jedného nukleotidu a sekvenovaní krátkych úsekov DNA. Vysoká presnosť, flexibilita, ľahká automatizácia a paralelné spracovanie sú výhodami pyrosekvenovania oproti technikám sekvenovania podľa Sangera.
Obrázok 03: Pyrosekvenovanie
Aký je rozdiel medzi Sangerovým sekvenovaním a pyrosekvenovaním?
Rozdielny článok v strede pred tabuľkou
Sangerovo sekvenovanie vs pyrosekvenovanie |
|
| Sangerovo sekvenovanie je metóda sekvenovania DNA založená na selektívnom začlenení ddNTP pomocou DNA polymerázy a terminácii reťazca. | Pyrosekvenovanie je metóda sekvenovania DNA založená na detekcii uvoľňovania pyrofosfátu po inkorporácii nukleotidu. |
| Použitie ddNTP | |
| ddNTP sa používajú na ukončenie replikácie DNA | ddNTP sa nepoužívajú. |
| Zúčastnené enzýmy | |
| Používa sa DNA polymeráza. | Používajú sa štyri enzýmy: DNA polymeráza, ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza. |
| Použité substráty | |
| APS a luciferín sa nepoužívajú. | Použije sa adenozín 5 'fosfosulfát (APS) a luciferín. |
| Maximálna teplota | |
| Toto je pomalý proces. | Toto je rýchly proces. |
Zhrnutie - Sangerovo sekvenovanie vs. pyrosekvenovanie
Sangerovo sekvenovanie a pyrosekvenovanie sú dve metódy sekvenovania DNA používané v molekulárnej biológii. Sangerovo sekvenovanie konštruuje poradie nukleotidov v poradí ukončením predĺženia reťazca, zatiaľ čo pyrosekvenovanie konštruuje presné poradie nukleotidov v sekvencii inkorporáciou nukleotidov a detekciou uvoľňovania pyrofosfátov. Preto hlavný rozdiel medzi Sangerovým sekvenovaním a pyrosekvenovaním spočíva v tom, že Sangerovo sekvenovanie funguje na sekvenovaní pomocou ukončenia reťazca, zatiaľ čo pyrosekvenovanie funguje na sekvenovaní syntézou.
