Kľúčový rozdiel - klonovanie vs subklonovanie
Klonovanie a subklonovanie sú molekulárne biologické postupy, ktoré vytvárajú zaujímavé geneticky identické bunky alebo organizmy nesúce DNA alebo gén. Klonovanie je technika, ktorá zahŕňa inzerciu požadovaného génu alebo DNA do vektora, ich replikáciu v hostiteľskej baktérii a produkciu buniek alebo organizmov, ktoré sú presnými kópiami genetického zloženia. Subklonovanie je technika, ktorá spočíva v inzercii požadovaného génu, ktorý je už vložený do vektora, do sekundárneho vektora, jeho replikácii v hostiteľskej baktérii a produkcii geneticky identických kópií buniek alebo organizmov. Kľúčový rozdiel medzi klonovaním a subklonovaním spočíva v tom, že pri klonovaní požadovaný gén, akonáhle je ligovaný do vektora, pokračuje v klonovacom procese, zatiaľ čo v subklonovaníuž klonovaný požadovaný gén sa oddelí od rodičovského vektora a znovu sa vloží do recipientného vektora a pokračuje v procese.
OBSAH
1. Prehľad a hlavný rozdiel
2. Čo je klonovanie
3. Čo je subklonovanie
4. Porovnanie vedľa seba - klonovanie vs. subklonovanie
5. Zhrnutie
Čo je klonovanie?
Klonovanie je postup, pri ktorom sa vytvárajú geneticky identické organizmy alebo bunky. V prírode sa klonovanie deje prostriedkami nepohlavného rozmnožovania. Ak nedôjde k genetickej rekombinácii alebo zmene, dostanú dcérske bunky rovnakú genetickú výbavu ako rodič. Prokaryotické a eukaryotické organizmy vytvárajú klony binárnym štiepením, pučaním, mitózou atď. V molekulárnej biológii je klonovanie génov alebo špecifických fragmentov DNA populárnou metódou na štúdium štruktúry a funkcie konkrétnej sekcie DNA.
Hlavným cieľom molekulárneho klonovania je vytvoriť milióny kópií geneticky identických buniek alebo organizmov nesúcich požadovaný fragment DNA (hlavne gény). Vytvára organizmy s presnými genetickými kópiami iného. Špecifické gény sa primárne klonujú v molekulárnych štúdiách na získanie štrukturálnych a funkčných informácií a na sekvenovanie DNA. Klonovanie sa tiež široko používa na výrobu špecifických proteínov alebo produktov vo veľkom meradle.
Postup klonovania
Základné kroky klonovacieho postupu sú nasledujúce.
- Identifikácia a izolácia požadovaného génu. (Amplifikácia požadovaného génu pomocou PCR).
- Restrikčné štiepenie požadovaného génu (restrikčná endonukleáza rozrezala gén).
- Reštrikčné štiepenie vektorovej DNA. (Vektorová DNA sa tiež štiepi pomocou rovnakej reštrikčnej endonukleázy).
- Vloženie génu do vektora a tvorba rekombinantnej molekuly.
- Transformácia rekombinantného vektora na hostiteľskú baktériu.
- Izolácia a identifikácia transformovaných baktérií (plazmidový vektor by mal obsahovať selektovateľný gén, najčastejšie gén rezistencie na antibiotiká na skríning transformovaných baktérií).
- Rekombinantná génová expresia v hostiteľovi.
Obrázok_01: Postup klonovania
Čo je to subklonovanie?
Subklonovanie je postup presunu požadovaného génu z jedného vektora do druhého vektora, aby sa zistila expresia génu na získanie požadovanej funkčnosti génu. V tejto metóde sú zapojené dva vektory; a to rodičovský vektor a cieľový vektor. Klonované vložky sa v subklonovaní presunú opäť do druhého vektora. Cieľom prenosu génu z prvého vektora do druhého vektora je získať niečo, čo by nebolo možné urobiť prvým vektorom, alebo znovu separovať gén v rámci už klonovaného fragmentu DNA a exprimovať ho sám. Pri tomto postupe sa na začiatku používajú reštrikčné enzýmy.
Postup subklonovania
Základné kroky subklonovania sú nasledujúce.
- Pomocou reštrikčných endonukleáz došlo k separácii požadovanej DNA v donorovom plazmide (pôvodný vektor).
- Amplifikácia požadovanej DNA pomocou PCR.
- Čistenie produktu PCR (požadovaná DNA) gélovou elektroforézou.
- Otvorenie recipientného plazmidu rovnakými reštrikčnými endonukleázami použitými na separáciu požadovanej DNA od pôvodného plazmidu.
- Ligácia požadovanej DNA (génu) do recipientného plazmidu za vzniku subklonovaného plazmidu.
- Transformácia subklonovaného vektora na kompetentnú hostiteľskú baktériu.
- Skríning transformovaných buniek.
- Purifikácia plazmidovej DNA a použitie na sekvenovanie DNA alebo expresiu génov na získanie požadovaných produktov.
Subklonovanie sa uskutočňuje pri príležitostiach izolácie jedného génu z klonovanej skupiny génov alebo keď sa vyžaduje prenos požadovaného génu do užitočného plazmidu, aby sa zistila presná funkcia požadovaného génu.
Obrázok_02: Postup subklonovania
Aký je rozdiel medzi klonovaním a subklonovaním?
Rozdielny článok v strede pred tabuľkou
Klonovanie vs subklonovanie |
|
| Klonovanie je postup, pri ktorom sa vytvárajú geneticky identické organizmy alebo bunky. | Subklonovanie je postup presunu požadovaného génu z jedného vektora do druhého vektora, aby sa zistila expresia génu na získanie požadovanej funkčnosti génu. |
| Proces | |
| Oddeľte požadovanú DNA od organizmu a vložte ju raz do vektora a klonujte | Už klonovaná DNA je oddelená od prvého vektora a vložená do druhého vektora a klonovaná. |
| Vložte pohyb pomocou vektorov | |
| Nepohybuje inzertmi (DNA, ktorá nás zaujíma) z jedného vektora do druhého vektora. | Presuňte vložky z nadradeného vektora do cieľového vektora. |
Zhrnutie - Klonovanie vs Subklonovanie
Klonovaním sa vytvárajú geneticky identické bunky alebo organizmy s vloženým požadovaným génom alebo DNA. Prebieha separáciou a inzerciou požadovanej DNA do vektora a expresiou v hostiteľskej baktérii. Subklonovanie zdieľa podobné kroky ako klonovanie. Avšak v subklonovaní je už klonovaný fragment DNA (požadovaný gén) vložený do vektora a transformovaný do hostiteľskej baktérie. To je kľúčový rozdiel medzi klonovaním a subklonovaním.
