Kľúčový rozdiel - SYBR Green vs Taqman
SYBR Green a Taqman sú dve metódy používané na detekciu alebo sledovanie procesu amplifikácie PCR v reálnom čase. SYBR Green je metóda založená na interkalácii farbiva na farbenie nukleových kyselín, zatiaľ čo Taqman je metóda založená na sonde hydrolýzy. Obe technológie sú navrhnuté tak, aby generovali fluorescenciu počas PCR, čo umožňuje prístroju PCR v reálnom čase sledovať reakciu v „reálnom čase“. Metóda SYBR Green sa uskutočňuje s použitím fluorescenčného farbiva nazývaného SYBR green a detekuje amplifikáciu väzbou farbiva na produkovanú dvojvláknovú DNA. Taqman sa uskutočňuje pomocou dvojito označených sond a detekuje amplifikáciu degradáciou sondy Taq polymerázou a uvoľňovaním fluoroforu. Toto je kľúčový rozdiel medzi SYBR Green a Taqman.
OBSAH
1. Prehľad a kľúčový rozdiel
2. Čo je SYBR Green
3. Čo je Taqman
4. Porovnanie vedľa seba - SYBR Green vs. Taqman
5. Zhrnutie
Čo je to SYBR Green?
SYBR Green je fluorescenčné farbivo používané na farbenie nukleových kyselín, najmä dvojvláknovej DNA v molekulárnej biológii. Na kvantifikáciu produktov PCR počas PCR v reálnom čase sa používa metóda SYBR Green. Po naviazaní na DNA výsledný komplex DNA-farbivo absorbuje modré svetlo a vyžaruje intenzívne zelené svetlo. Stáva sa to v dôsledku štrukturálnej zmeny, ktorá nastáva v molekule farbiva po naviazaní na dvojvláknovú DNA. Keď PCR vytvára čoraz viac DNA, viaže sa viac molekúl farbiva s DNA, čo generuje viac fluorescencie. Preto sa fluorescencia zvyšuje s akumuláciou produktu PCR. Množstvo produktu PCR je teda možné kvantitatívne merať pomocou fluorescenčnej detekcie SYBR Green.
SYBR zelené farbivo sa môže tiež použiť na značenie DNA v cytometrii a fluorescenčnej mikroskopii. Ethídiumbromid bol úspešne nahradený produktom SYBR Green, pretože Ethidiumbromid je karcinogénne farbivo, ktoré má problémy s likvidáciou počas vizualizácie DNA v gélovej elektroforéze.
Existujú výhody a nevýhody metódy SYBR green. Táto metóda je veľmi citlivá, lacná a ľahko použiteľná. Avšak kvôli svojej schopnosti viazať sa na akúkoľvek dvojvláknovú DNA môže nešpecifická väzba viesť k nadmernej kvantifikácii produktu PCR.
Obrázok 01: Zelená technika SYBR
Čo je Taqman?
Taqman je alternatívnou metódou na sledovanie procesu PCR v reálnom čase k SYBR Green. Táto metóda závisí od aktivity 5 '- 3' exonukleázy enzýmu Taq polymerázy, aby degradovala sondy počas predlžovania nového vlákna a uvoľňovania fluoroforu. Pri tejto metóde sa používajú dvojito označené sondy, ktoré sú založené na hydrolýze sond. Sondy sú fluorescenčne značené DNA oligonukleotidy, ktoré majú na 5 'konci fluorescenčnú reportérovú molekulu (fluorofor) a na 3' konci zhášaciu molekulu. Sú navrhnuté tak, aby sa viazali na jednovláknovú šablónu na opačnej strane žíhania primeru. Taq polymeráza pridáva nukleotidy k priméru a predlžuje nové vlákno smerom k dvojznačeným sondám. Akonáhle sa Taq polymeráza stretne so sondou, exonukleázové pôsobenie Taq polymerázy aktivuje a degraduje sondu. Po dokončení syntézy nového vlákna je sonda podrobená úplnej degradácii a uvoľneniu fluoroforu. Uvoľňovanie fluoroforu generuje fluorescenciu. Fluorescenčná zhášacia molekula účinne zháša emitované svetlo a vytvára výstup na kvantifikáciu produktu PCR. Uvoľňovanie fluoroforov a množstvo produktov PCR sú proporcionálne. Preto je možné kvantifikáciu ľahko uskutočniť Taqmanovou metódou.kvantifikácia sa dá ľahko urobiť Taqmanovou metódou.kvantifikácia sa dá ľahko urobiť Taqmanovou metódou.
Obrázok 02: Taqmanova metóda
Metóda Taqman sa používa v PCR v reálnom čase, kvantifikácia génovej expresie, detekcia genetických polymorfizmov, kvantifikácia delécií chromozomálnej DNA, bakteriálna identifikácia, overenie analýzy mikročipov, genotypizácia SNP atď.
Aký je rozdiel medzi SYBR green a Taqman?
Rozdielny článok v strede pred tabuľkou
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green je založený na farbive viažucom DNA. | Taqman závisí od hybridizačných sond a od 5 'do 3' exonukleázovej aktivity Taq polymerázy. |
| Fluorescenčne označené sondy | |
| Nie sú potrebné žiadne fluorescenčne označené sondy. | Vyžadujú sa sondy s dvojitým označením. |
| Multiplexová génová analýza | |
| Nemôže sa použiť na multiplexové génové ciele. | Môže sa použiť na multiplexové génové ciele. |
| Náklady | |
| To je lacnejšie. | To je nákladnejšie. |
| Špecifickosť | |
| To je menej špecifické a viaže sa s akoukoľvek dvojvláknovou DNA | Sú veľmi špecifické, pretože sondy detekujú špecifické produkty amplifikácie. |
| Efektívnosť | |
| To je menej efektívne. | To je vysoko efektívne. |
| Aplikácia | |
| Používa sa pri PCR v reálnom čase, vizualizácii na agarózovom géli, označovaní DNA atď. | Používa sa pri PCR v reálnom čase, kvantifikácii génovej expresie, detekcii genetických polymorfizmov atď. |
Zhrnutie - SYBR Green a Taqman
Taqman a SYBR green sú dve metódy používané v PCR v reálnom čase (kvantitatívna PCR). Obe metódy umožňujú efektívnu kvantifikáciu produktu PCR a sú založené na emisii fluorescencie. Metóda Taqman používa na detekciu akumulovanej DNA sondy s dvojitým označením, zatiaľ čo metóda SYBR Green používa fluorescenčné farbivo. Obe tieto metódy majú tiež rôzne aplikácie v molekulárnej biológii.
