Kľúčový rozdiel medzi helikázou a topoizomerázou je v tom, že helikáza je enzým, ktorý oddeľuje dva komplementárne reťazce DNA štiepením vodíkových väzieb medzi bázami dvoch vlákien, zatiaľ čo topoizomeráza je enzým, ktorý odstraňuje pozitívne a negatívne supercoily tvorené počas procesu odvíjania DNA rezaním a opätovné uzavretie jedného alebo oboch vlákien DNA duplexu.
DNA je dvojitá špirála. Existuje v dvoch komplementárnych reťazcoch navzájom spojených vodíkovými väzbami. Replikácia, transkripcia a oprava DNA vyžadujú oddelenie dvoch reťazcov od seba, aby sa vytvorili nové kópie, vytvorila sa mRNA a na opravu sa pridali nukleotidy. V tomto okamihu vstupujú do hry dva enzýmy helikáza a topoizomeráza. Preto sú pri odvíjaní DNA nevyhnutné ako helikáza, tak topoizomerázy. Helikáza separuje dvojvláknovú DNA na jednotlivé vlákna rozbitím vodíkových väzieb medzi pármi nukleotidových báz v dvojvláknovej DNA. Naproti tomu topoizomeráza odkrýva krútenie DNA a zmierňuje povahu superšikmelu DNA rezaním reťazca fosfátu DNA buď v jednom alebo v obidvoch reťazcoch.
