Kľúčový rozdiel - Microarray vs sekvenovanie RNA
Transkriptóm predstavuje celý obsah RNA prítomnej v bunke vrátane mRNA, rRNA, tRNA, degradovanej RNA a nedegradovanej RNA. Profilovanie transkriptomu je dôležitý proces na pochopenie poznatkov o bunkách. Existuje niekoľko pokročilých metód profilovania transkriptomov. Mikročip a sekvenovanie RNA sú dva typy technológií vyvinutých na analýzu transkriptomu. Kľúčovým rozdielom medzi mikročipom a sekvenovaním RNA je, že mikročip je založený na hybridizačnom potenciáli vopred určených značených sond s cieľovými sekvenciami cDNA, zatiaľ čo sekvenovanie RNA je založené na priamom sekvenovaní reťazcov cDNA pomocou pokročilých postupov sekvenovania, ako je NGS. Microarray sa uskutočňuje s predchádzajúcimi poznatkami o sekvenciách a sekvenovanie RNA sa uskutočňuje bez predchádzajúcich znalostí o sekvenciách.
OBSAH
1. Prehľad a hlavný rozdiel
2. Čo je to Microarray
3. Čo je to sekvenovanie RNA
4. Porovnanie vedľa seba - Microarray vs. sekvenovanie RNA
5. Zhrnutie
Čo je Microarray?
Microarray je robustná, spoľahlivá a vysoko priepustná metóda používaná na transkriptómové profilovanie vedcami. Je to najpopulárnejší prístup k analýze prepisov. Jedná sa o nízkonákladovú metódu, ktorá závisí od hybridizačných sond.
Táto technika začína extrakciou mRNA zo vzorky a konštrukciou knižnice cDNA z celkovej RNA. Potom sa zmieša s fluorescenčne označenými vopred navrhnutými sondami na pevnom povrchu (bodová matrica). Komplementárne sekvencie hybridizujú so značenými sondami v microarray. Potom sa mikročip premyje a preoseje a obraz sa kvantifikuje. Zhromaždené údaje by sa mali analyzovať, aby sa získali profily relatívnych výrazov.
Intenzita mikromaticových sond sa považuje za proporcionálnu k množstvu prepisov vo vzorke. Presnosť techniky však závisí od navrhnutých sond, predchádzajúcej znalosti sekvencie a afinity sond k hybridizácii. Preto má technológia microarray obmedzenia. Techniku microarray nie je možné vykonať s prepismi s nízkou hojnosťou. Nedokáže diferencovať izoformy a identifikovať genetické varianty. Pretože táto metóda závisí od hybridizácie sond, vyskytujú sa v technike microarray určité problémy spojené s hybridizáciou, ako je krížová hybridizácia, nešpecifická hybridizácia atď.
Obrázok 01: Microarray
Čo je sekvenovanie RNA?
Sekvenovanie brokovnice RNA (RNA seq) je nedávno vyvinutá technika sekvenovania celého transkriptomu. Je to rýchla a vysoko výkonná metóda transkriptomového profilovania. Priamo kvantifikuje expresiu génov a vedie k hlbokému výskumu transkriptomu. RNA seq nezávisí na vopred určených sondách alebo predchádzajúcich znalostiach sekvencií. Preto má metóda RNA seq vysokú citlivosť a schopnosť detegovať nové gény a genetické varianty.
Metóda sekvenovania RNA sa uskutočňuje prostredníctvom niekoľkých krokov. Celková RNA bunky musí byť izolovaná a fragmentovaná. Potom musí byť pomocou reverznej transkriptázy pripravená cDNA knižnica. Každý reťazec cDNA musí byť ligovaný pomocou adaptérov. Potom musia byť ligované fragmenty amplifikované a purifikované. Nakoniec sa musí použiť metóda NGS, musí sa uskutočniť sekvenovanie cDNA.
Obrázok 02: Sekvenovanie RNA
Aký je rozdiel medzi Microarray a sekvenovaním RNA?
Rozdielny článok v strede pred tabuľkou
Microarray vs sekvenovanie RNA |
|
| Microarray je robustná, spoľahlivá a vysoko priepustná metóda. | Sekvenovanie RNA je presná a vysoko výkonná metóda. |
| Náklady | |
| Toto je nízkonákladová metóda. | Toto je drahá metóda. |
| Analýza veľkého počtu vzoriek | |
| To umožňuje analyzovať veľké množstvo vzoriek súčasne. | To umožňuje analyzovať veľké množstvo vzoriek. |
| Analýza dát | |
| Analýza údajov je zložitá. | Pri tejto metóde sa generuje viac údajov; preto je proces zložitejší. |
| Predchádzajúce znalosti sekvencií | |
| Táto metóda je založená na hybridizačných sondách, takže je nutná predchádzajúca znalosť sekvencií. | Táto metóda nezávisí od predchádzajúcich znalostí sekvencie. |
| Štrukturálne variácie a nové gény | |
| Táto metóda nedokáže zistiť štrukturálne variácie a nové gény. | Táto metóda dokáže detegovať štrukturálne variácie, ako napríklad fúziu génov, alternatívne zostrihy a nové gény. |
| Citlivosť | |
| To nedokáže zistiť rozdiely v expresii izoforiem, takže to má obmedzenú citlivosť. | Toto má vysokú citlivosť. |
| Výsledok | |
| To môže viesť iba k relatívnym úrovniam expresie. Toto neposkytuje absolútnu kvantifikáciu génovej expresie. | Poskytuje absolútne a relatívne úrovne vyjadrenia. |
| Analýza údajov | |
| To je potrebné opakovať, aby bolo možné znovu analyzovať. | Sekvenčné údaje je možné opätovne analyzovať. |
| Potreba konkrétneho personálu a infraštruktúry | |
| Pre microarray nie je potrebná špecifická infraštruktúra a personál. | Špecifická infraštruktúra a personál potrebný na sekvenovanie RNA. |
| Technické problémy | |
| Technika microarray má technické problémy, ako je krížová hybridizácia, nešpecifická hybridizácia, obmedzená miera detekcie jednotlivých sond atď. | Technika RNA seq sa vyhýba technickým problémom, ako je krížová hybridizácia, nešpecifická hybridizácia, obmedzená miera detekcie jednotlivých sond atď. |
| Zaujatosti | |
| Toto je neobjektívna metóda, pretože závisí od hybridizácie. | Predpätie je v porovnaní s microarray nízke. |
Zhrnutie - Microarray vs sekvenovanie RNA
Metódy microarray a RNA sú vysoko výkonné platformy vyvinuté pre transkriptómové profilovanie. Obidve metódy poskytujú výsledky, ktoré vysoko korelujú s profilmi génovej expresie. Avšak sekvenovanie RNA má výhody oproti microarray pre analýzu génovej expresie. Sekvenovanie RNA je citlivejšou metódou na detekciu transkriptov s nízkou abundanciou ako microarray. Sekvenovanie RNA tiež umožňuje diferenciáciu medzi izoformami a identifikáciu génových variantov. Microarray je však bežnou voľbou väčšiny výskumníkov, pretože sekvenovanie RNA je nová a nákladná technika s výzvami na ukladanie údajov a komplexnou analýzou údajov.
